前期研究显示金黄地鼠可作为新冠感染的潜在模型，Imai等人发现新冠UT-NCGM02和UW-001毒株感染金黄地鼠后可出现新冠患者间质性肺炎等症状[1, 2]。为进一步检测金黄地鼠感染SARS-CoV-2武汉毒株的表型，为研究新冠感染的发病机制、疫苗评价和研发治疗药物等提供良好的动物模型，我们采用武汉毒株建立了SARS-CoV-2感染的COVID-19金黄地鼠模型。

1.Le Bras, A. Syrian hamsters as a small animal model for COVID-19 research.Lab Anim (NY). 2020;49(8):223.

2.Imai M, et al. Syrian hamsters as a small animal model for SARS-CoV-2 infection and countermeasure development. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117 (28) 16587-16595

1.实验材料

1.1 SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN/MT093631.2)毒株由中国医学科学院医学实验动物研究所分离并保存。

1.2 实验动物

叙利亚仓鼠（Syrian golden hamster），又名金黄地鼠，14-16周，雌雄不限。

2.实验环境

所有涉及的病毒实验操作全部在中国医学科学院医学实验动物研究所ABSL-3实验室完成，该实验室已经具备相关实验室和福利伦理资质。

3.病原培养鉴定

将新型冠状病毒接种到Vero细胞进行分离和储存。Vero细胞培养在DMEM（英潍捷基, 美国）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素的培养基中，环境为37°C，5%CO2。新型冠状病毒的病毒滴度用标准的半数细胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID50）进行分析。

4.实验操作规程

4.1 动物模型的感染方法

（1） 途径：滴鼻；

（2） 感染剂量：1×106TCID50 只；

（3） 感染体积：100μl/只；

（4） 对照组：等体积 PBS。

4.2动物模型分析

（1）症状观察：感染后，每天观察动物一般症状，记录体重，体温等。

（2）病毒载量：定期收集各组动物脏器（包括咽拭子），进行RNA抽提，利用RT-PCR技术，检测组织中病毒载量。RT-PCR所用的新型冠状病毒引物如下：上游为5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游为5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。

（3）病毒分离：肺组织在 DMEM 溶液中研磨制备成匀浆，离心分离上清后，接种于Vero细胞分离病毒并观察细胞病变。

（4）病理学观察：用新鲜的组织福尔马林固定，制备石蜡切片，用HE，PAS等特染，免疫组化或荧光染色，镜下观察。

（5）免疫组化和荧光染色肺脏切片用PBS洗三遍，用固定液充分固定，用封闭液室温封闭 1h，一抗4°C 封闭过夜，PBS洗三遍，二抗37°C 孵育1 小时， PBS 洗三遍。用 DAPI 染细胞核观察新型冠状病毒在金黄地鼠肺脏等各脏器的分布。新型冠状病毒一抗为病人恢复期血清，羊源抗人二抗用， FITC 标记。

4.4数据统计处理方法

所有的数据用GraphPad Prism 8.0 软件分析，感染组和照组用T 检验方法分析差异，显著性差异用*p ﹤ 0.05, **p﹤0.01 或者 #p﹤0.05, ##p﹤0.01 表示。

4.5 动物伦理

实验动物涉及的内容符合实验动物伦理，并通过实验动物伦理审批 (LJN20004)。

1、细胞/基因/病原/蛋白表达/免疫组化 鉴定、病原学检查信息

（1）咽拭子检测：病毒感染后0-7dpi的咽拭子检测（Figure1）。分别在感染后第 1、3和5天可检测到咽拭子中的大量的病毒核酸，在病因上成功模拟COVID-19.

Figure1.Viral RNA (log10 RNA copies/mL)by qRT-PCR assay detected in the throat swabs at 0, 1, 3, 5, and 7 dpi.

（2）各脏器病毒检测：感染后3dpi、5dpi和7dpi在鼻甲、肺和气管可检测到SARS-CoV-2核酸的存在（Figure 2）。另外我们还在个别金黄地鼠的脾、淋巴结、肾、肾上腺和生殖系统中检测到了SARS-CoV-2（Table1）。

Figure 2. Viral RNA (log10 RNA copies/g) by qRT-PCR assay detected in the respiratory tract

tissues and extrapulmonary organ tissues of SARS-CoV-2-challenged hamsters at 3, 5, and 7 dpi.

2、表型分析（包括生理生化、解剖学、生物学特征等）

感染7dpi后大体解剖可见肺组织出现深红色多灶性病变，斑块大小不一，或散在或连成一片（Figure 3）。但未见胃肠、肝、肾、脑等其它脏器的明显病变。

Figure 3. The gross pathological features from SARS-CoV-2 infected mice lung tissue.

Left: control group; Right: SARS-CoV-2 infected group.

3、影像/行为/临床/病理表型

（1）大体观察：临床症状观察包括动物的体重变化，一般症状观察（弓背、竖毛、反应度降低等）等。与部分患者相似，动物感染后主要表现为体重轻微下降（Figure 4）。

Figure 4. Body weight changes in Syrian hamsters after viral infection at 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 18, 21, 30, 33, 35, and 37 days post inoculation (dpi). The mock-infected hamsters were examined at 0, 1, 3, 5, and 7 dpi.

（2）病理学检测发现，被感染动物的肺组织出现间质性肺炎，呈重度间质性肺炎改变，可见肺泡隔增宽、炎细胞浸润，血管周围炎细胞浸润，肺泡腔内可见巨噬细胞及少量蛋白渗出，在间质性肺炎和巨噬细胞浸润方面与临床一致（Figure 5）。

Figure 5.Histopathological changes of the lung at 5, 7, 18, 37 dpi. The viral pathology in the lungs was observed by hematoxylin and eosin (H&E) staining. Viral Sprotein was examined by immunohistochemistry (IHC). Viral RNA was detected by in situ hybridization (ISH). The black frames in the corners are a magnification ofthe region in the respective panel of IHC and ISH. Exudation was tested by periodic acid-Schiff (PAS) staining. Collagenous fibers were stained bymodified Massonstaining. Data are representative of three independent experiments.

另外，我们还发现部分金黄地鼠的脾、淋巴结、肾、肾上腺、生殖腺等脏器存在病理损伤（Figure 6）。

Figure6.The adrenal gland was severely affected, and SARS-CoV-2 was detected throughout the adrenal gland at 7 dpi. (A–C) Mild adrenal gland changes accompanied by few inflflammatory foci were observed in one infected hamster at 7 dpi. (D,G,J,K) Multifocal inflflammatory cells, mainly including neutrophilic cells and lymphocytes, were scattered in the adrenal cortex and medulla. (E,H) Robust viral RNA expression was detected by ISH in the adrenal cortex and medulla. (F,I) The adrenal medulla was atrophied, as confifirmed by synaptophysin proteinstaining. (L–N) The expression of viral S protein was further confifirmed by IHC, mainly in the

cellular cytoplasm. (O–Q) Abundant vascular endothelial cells were stained for a biomarker,CD31. (R–T) A mass of CD19-positive cells was stained, confifirming the aggregation of B lymphocytes. Sequential sections were stained by H&E and subjected to ISH and IHC. Data are representative of three independent experiments.

微生物菌株管理、使用，vero细胞系的使用和动物模型制备过程中遵循动物福利和各项管理制度，动物无逃逸。所有涉及的病毒实验操作全部在中国医学科学院医学实验动物研究所ABSL-3实验室完成。 模型制备完成后福尔马林固定，在蛋白核酸等成分固定后进行病理染色分析，对环境和生态并未产生明显影响。

1. 动物模型评价方法和指标体系

本实验建立的新型冠状病毒金黄地鼠模型采用监测临床症状、病毒学、病理学等方法进行分析和鉴定，确定该动物模型成功建立 。

（1）大体观察：感染后每天监测体温，记录一般症状、体重，监测周期37天。动物感染后1-7天出现体重下降。

（2）病毒学监测发现，金黄地鼠在感染后第1、3、5天可检测到咽拭子的病毒载量。用免疫组织化学和原位杂交可在肺等脏器内也检测到病毒存在。病因上成功模拟COVID-19。

（3）病理学检测发现，被感染动物的肺组织出现间质性肺炎呈重度间质性肺炎改变，可见肺泡隔增宽、炎细胞浸润，血管周围炎细胞浸润，肺泡腔内可见巨噬细胞及少量蛋白渗出，在间质性肺炎和巨噬细胞浸润方面与临床一致。

综上我们制备的模型模拟了部分普通型和重型感染病人的主要指标，模型构建成功。

2.与其他新冠肺炎的小鼠和猫模型相比，金黄地鼠模型的肺组织表现为重度间质性肺炎，同时，金黄地鼠可出现脾、淋巴结、肾、肾上腺、心、生殖系统等多脏器的病理损伤。

3.应用该模型，可开展重型新冠肺炎相关机制和防治措施的研究。