1、病原（细胞/基因/病原/其他造模因素）信息

SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN/MT093631.2)毒株由中国医学科学院医学实验动物研究所分离并保存。Vero E6细胞用于SARS-CoV-2的接种和复制。

2、实验动物背景信息

虎斑猫（9月龄-12月龄），雌雄不限，4×105TCID50/只病毒液滴鼻感染，400 μl/只。感染第3天进行相关指标检测。

3、研究背景

家猫(Felis domesticus)与人类密切接触，近来由于其对SARS-CoV-2的易感性而受到关注。研究表明，SARS-CoV-2感染的实验猫可通过呼吸道飞沫(1,2)或直接接触将病毒传播给其他猫(3-5)。另一份报告显示，在武汉爆发疫情期间，约14.7%的猫感染了SARS-CoV-2(6)。此外，据报道，一只同伴猫被其在比利时感染COVID-19的宿主感染(纽约邮报)。上述报告表明，猫可能通过在实验室接种或接触受感染的主人而感染SARS-CoV-2。

然而，与家猫是否可作为COVID-19的动物模型，以及家猫感染SARS-CoV-2相关的特征、猫对猫传播SARS-CoV-2的潜在风险、猫之间传播的有效性或病毒向环境或宠物主人的溢出仍不清楚。尽管有些病例报告了SARS-CoV-2从人传染给家猫，但从猫等宠物获得的人类感染仍然令人担忧。因此，我们采用滴鼻途径将SARS-CoV-2接种于家猫，从病毒学、免疫学与病理等方面验证其作为COVID-19动物模型的潜力，并为研究家猫感染SARS-CoV-2后的特征、猫与猫及与人传播的潜在风险、传播途径与相关机制的研究提供工具。

1.Shi J, Wen Z, Zhong G, Yang H, Wang C, Huang B, et al. Susceptibility of ferrets, cats, dogs, and other domesticated animals to SARS-coronavirus 2. Science (New York, NY). 2020 May 29;368(6494):1016-20.

2.Bosco-Lauth AM, Hartwig AE, Porter SM, Gordy PW, Nehring M, Byas AD, et al. Experimental infection of domestic dogs and cats with SARS-CoV-2: Pathogenesis, transmission, and response to reexposure in cats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2020 Oct 20;117(42):26382-8.

3.Halfmann PJ, Hatta M, Chiba S, Maemura T, Fan S, Takeda M, et al. Transmission of SARS-CoV-2 in Domestic Cats. The New England journal of medicine. 2020 Aug 6;383(6):592-4.

4.Segalés J, Puig M, Rodon J, Avila-Nieto C, Carrillo J, Cantero G, et al. Detection of SARS-CoV-2 in a cat owned by a COVID-19-affected patient in Spain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2020 Oct 6;117(40):24790-3.

5.Barrs VR, Peiris M, Tam KWS, Law PYT, Brackman CJ, To EMW, et al. SARS-CoV-2 in Quarantined Domestic Cats from COVID-19 Households or Close Contacts, Hong Kong, China. Emerging infectious diseases. 2020 Sep 16;26(12).

6.Zhang Q, Zhang H, Gao J, Huang K, Yang Y, Hui X, et al. A serological survey of SARS-CoV-2 in cat in Wuhan. Emerging microbes & infections. 2020 Dec;9(1):2013-9.

1.实验材料

1.1 SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN/MT093631.2)毒株由中国医学科学院医学实验动物研究所分离并保存。

1.2 实验动物

虎斑猫（9月龄-12月龄），雌雄不限。

2.实验环境

所有涉及的病毒实验操作全部在中国医学科学院医学实验动物研究所ABSL-3实验室完成，该实验室已经具备相关实验室和福利伦理资质。

3.病原培养鉴定

将新型冠状病毒接种到Vero细胞进行分离和储存。Vero细胞培养在DMEM（英潍捷基, 美国）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素的培养基中，环境为37°C，5%CO2。新型冠状病毒的病毒滴度用标准的半数细胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID50）进行分析。

4.实验操作规程

4.1 动物模型的感染方法

（1） 途径：滴鼻；

（2） 感染剂量：4× 105TCID50 只；

（3） 感染体积：400μl/只；

（4） 对照组：等体积 PBS。

4.2动物模型分析

（1）症状观察：感染后，每天观察动物一般症状，记录体重，体温等。

（2）病毒载量：定时收集各组动物脏器（包括咽拭子和肛拭子），进行RNA抽提，利用RT-PCR技术，检测组织中病毒载量。RT-PCR所用的新型冠状病毒引物如下：上游为5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游为5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。

（3）病毒分离：肺组织在 DMEM 溶液中研磨制备成匀浆，离心分离上清后，接种于Vero细胞分离病毒并观察细胞病变。

（4）病理学观察：用新鲜的组织福尔马林固定，制备石蜡切片，用HE，PAS等特染，免疫组化或荧光染色，镜下观察。

（5）免疫组化和荧光染色肺脏切片用PBS洗三遍，用固定液充分固定，用封闭液室温封闭 1h，一抗4°C 封闭过夜，PBS洗三遍，二抗37°C 孵育1 小时， PBS 洗三遍。用 DAPI 染细胞核观察新型冠状病毒在猫肺脏等脏器的定位。新型冠状病毒一抗为病人恢复期血清，羊源抗人二抗用， FITC 标记。

（6）感染后第11天和14天，分离血清，测定特异性IgG。

4.4数据统计处理方法

所有的数据用GraphPad Prism 8.0 软件分析，感染组和对照组用T 检验方法分析差异，显著性差异用*p ﹤ 0.05, **p﹤0.01 或者 #p﹤0.05, ##p﹤0.01 表示。

4.5 动物伦理

实验动物涉及的内容符合实验动物伦理，并通过实验动物伦理审批 (LJN20003)。

1、细胞/基因/病原/蛋白表达/免疫组化 鉴定、病原学检查信息

（1）病原鉴定：病毒感染后0-14dpi的咽拭子和肛拭子检测（Figure1）。分别在感染后第1、3、5、7、9、11天可检测到咽拭子中的病毒核酸，在3、5、7、9、11天可检测到肛拭子中的病毒核酸，在病因上成功模拟COVID-19.

Figure1.Viral replication from throat and anal swabs. SARS-CoV-2 RNA was detected via qRT-PCR from swabs from 6 infected cats at the indicated time points. The red solid lines represent the average of all animals at the indicated time points.

（2）免疫荧光鉴定：抗体检测到肺和小肠内有SARS-CoV-2的存在（Figure 2）。

Figure 2. Colocalization of the cat ACE2 receptor by SARS-CoV-2. Two infected cats from P0 were euthanized at 14 dpi. SARS-CoV-2 (green) and feline ACE2 (red) were localized in the lungs (A) and intestines (B). The SARS-CoV-2 antigen and feline ACE2 receptor are shown colocalized in yellow. The nuclei were stained with DAPI (blue). Inserts show higher magnification of the smaller box. Sections from 2 uninfected cats were used as negative controls. Data are representatives of 3 independent experiments. Abbreviations:ACE2,angiotensin-

converting enzyme 2; DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; dpi, days postinfection; SARS-CoV-2, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.

2、表型分析（包括生理生化、解剖学、生物学特征等）

大体解剖未见肺、胃肠等各脏器有明显异常。

病毒感染后11-14天可检测到明显的抗体产生（Figure 3）。

Figure 3. Levels of binding antibody against SARS-CoV-2. SARS-CoV-2 spike 1-specific antibodies from different passage groups were examined and compared at 0, 11, and 14 dpe.

3、影像/行为/临床/病理表型

（1）大体观察：临床症状观察包括动物的体重变化，一般症状观察（弓背、竖毛、反应度降低等）等。与部分患者相似，动物感染后主要表现为体重轻微下降（Figure 4）和腹泻，没有其他明显的症状。

Figure 4. Clinical signs in each domestic cat. A, Changes in body temperature and B body weight in the cats were recorded at the indicated time points after SARS-CoV-2 challenge.

（2）病理学检测发现，被感染动物的肺组织出现间质性肺炎，呈弥漫性中度间质性肺炎改变，可见肺泡隔增宽、炎细胞浸润，血管周围炎细胞浸润，肺泡腔内可见巨噬细胞及少量蛋白渗出，在间质性肺炎和巨噬细胞浸润方面与临床一致。另外可见细支气管周围明显渗出，小肠肌层炎细胞浸润，脾脏脾脏生发中心淋巴细胞减少，淋巴结内淋巴细胞萎缩、变性和坏死（Figure 5）。

Figure 5. Histopathological changes and IHC examination of thelungs of SARS-CoV-2–infected cats. Lung tissues from infected cats (C0-5 and C0-6) were collected at 7 dpi and stained with H&E. SARS-CoV-2 antigens were detected with anti-spike antibody 7D2 via IHC examination. Compared with the normal controls, modified Masson’s trichrome staining revealed few collagen fibers (blue-stained fibers) in the thickened alveolar interstitium of the lungs of infected cats. Histopathological changes and PAS staining of the bronchioles of SARS-CoV-2–infected cats were shown. F, Extrarespiratory histopathological changes in the SARS-CoV-2–infected cats. Lesions were found in the intestines, spleen, and lymph nodes by H&E staining. Ahighermagnification of the boxed area is shown to the right of each image. Black scale bar = 100µm, red scale bar = 50µm. All data represent 3 independent experiments. Abbreviations: dpi, days postinfection; H&E, hematoxylin and eosin; IHC, immunohistochemistry; PAS, periodicacid-Schiff.

微生物菌株管理、使用，vero细胞系的使用和动物模型制备过程中遵循动物福利和各项管理制度，动物无逃逸。所有涉及的病毒实验操作全部在中国医学科学院医学实验动物研究所ABSL-3实验室完成。 模型制备完成后福尔马林固定，在蛋白核酸等成分固定后进行病理染色分析，对环境和生态并未产生明显影响。

1. 动物模型评价方法和指标体系

本实验建立的新型冠状病毒猫模型采用监测临床症状、病毒学、病理学和免疫学等方法进行分析和鉴定，确定该动物模型成功建立 。

（1）大体观察：感染后每天监测体温，记录一般症状、体重，监测周期14天。动物出现体重下降和腹泻等临床症状。

（2）病毒学监测发现，猫在感染后第1、3、5、7、9、11、14天可检测到咽拭子和肛拭子进行病毒载量检测。结果显示在鼻咽部可持续 10天检测到大量病毒核酸，在消化道可持续检测到病毒核酸的时间为 7天。其中，鼻部和咽部的病毒高峰期在第 3 天，消化道的病毒高峰期在第 7 天。用免疫组织化学和免疫荧光法在第7天和14天在肺和肠道内也检测到病毒存在。病因上成功模拟COVID-19。

（3）病理学检测发现，被感染动物的肺组织出现间质性肺炎呈中度间质性肺炎改变，可见肺泡隔增宽、炎细胞浸润，血管周围炎细胞浸润，肺泡腔内可见巨噬细胞及少量蛋白渗出，在间质性肺炎和巨噬细胞浸润方面与临床一致。

（4）免疫学检测发现，感染后动物可产生IgG，但是产生的时间具有个体差异，以上表现与临床患者极为接近。

综上我们制备的模型模拟了部分无症状、轻型和普通型感染病人的主要指标，模型构建成功。

2.与其他新冠肺炎的小鼠和仓鼠模型相比，实验猫模型的体重和体温变化不明显，肺组织表现为中度间质性肺炎，病程较长，感染后14天仍可见间质性肺炎。同时，实验猫表现出特异的细支气管炎，猫肠道中可以观察到病毒存在。

3.应用该模型，可开展家猫感染SARS-CoV-2后的特征、猫与猫及与人传播的潜在风险、传播途径与相关机制的研究，以及应用于相关防治措施的开发。