一、疾病概述

社会型人格障碍(antisocialpersonality disorder)又称无情型人格障碍是对社会的危害更为严重的一种精神疾病类型。该病是一种犯罪型人格障碍，其患病率在发达的国家为4.3-9.4%，其特征是高度攻击性，行为受偶然动机驱使，社会和人际关系适应不良，常有较严重的反社会行为，危害自己及他人的生命和财产安全（沈渔邨等，2009）。目前造成抑郁症、孤独症以及反社会行为的遗传机制不明，因此本模型的目的是揭示机体响应外在社会压力，并调控个体社会行为的主要基因，及其作用通路，作用脑区,为明确动物行为调控的分子机制，预防和治疗精神疾病提供依据。

二、模型背景

1、xx（细胞/基因/病原/其他造模因素）信息

布氏田鼠NAcc脑区确认，由于布氏田鼠没有标准的脑图谱，根据文献及实际对比发现布氏田鼠脑区分布与大鼠脑区分布相似度较高，所以我们参照大鼠脑图谱分布对比4月龄正常雄性布氏田鼠脑部冰冻连续切片，初步确认4月龄布氏田鼠NAcc脑区三维坐标，然后对4月龄正常雄性布氏田鼠NAcc脑区注射滂胺天蓝（扩散性弱）确认注射位置的准确性，以脑部前囟为零点坐标(X，Y，Z)，NAcc脑区三维坐标(X：1.6 mm，Y：±:1.3 mm，Z：-5.0 mm)。并且在行为学实验结束后，取材前每只实验鼠都要再注射滂胺天蓝，以便在后续实验中再次确认脑区注射位置。一般国际上对小鼠特定脑区注射正确率也是处于60%左右,注射错误的数据剔除。我们前期实验组做了布氏田鼠伏隔核和内侧杏仁核区的立体定位和注射最后核定,注射位置正确率为90%。动物取50g雄性田鼠，注射OT受体阻断剂组。麻醉后用特定NAc脑区立体定位仪埋管，手术恢复7-10天后，动物体重在50g左右，而且行为没有异常，微量进样器给药，然后进行行为学实验：包括识别实验和中央竞技场实验。

2、实验动物背景信息

布氏田鼠以家族为单位群居，种群内个体间表现出明显的亲社会社交行为。我们推测该行为有其进化出的可遗传的分子调控机制，而催产素和其受体就是一个重要的调控分子。

3、研究背景

该动物模型的研究目的及意义；该动物模型的国内外研究进展并附参考文献。

催产素是丘脑的视上核（SON）和室旁核（PVN）区催产素能神经元分泌的9肽分子，催产素通过结合其他部位的催产素受体发挥相应的功能。催产素受体（oxytocinreceptor，OTR）是G蛋白偶联受体，分布于脑部的下丘脑的腹内侧核、杏仁核、侧隔核、终纹床核、苍白球、室旁核、视上核、伏隔核等区域(Adan et al. 1995, Ostrowski. 1998, Moaddabet al. 2015)。研究发现催产素可以调节人和动物的社会行为，并与抑郁症、孤独症、焦虑症等精神类疾病的发病机制相关(Tyzio et al. 2014, Tao et al. 2015, Harony et al. 2017)。2015 年Arakawa等人通过对C57小鼠进行侧脑室分别注射OT和催产素受体抑制剂（oxytocin receptor antagonist , OTRA)来验证OT对动物群体间社会识别的影响，注射催产素OTRA组小鼠在面对陌生刺激鼠时，领地气味标记行为比注射脑脊液的对照组小鼠多，而注射OT组小鼠的标记行为比对照组少，由此他们就推断OT促进群体之间的社会交流，使个体的亲社会行为增加。野生型小鼠的Cntnap2和催产素能神经元在PVN区共表达，Cntnap2基因敲除小鼠（孤独症小鼠）的催产素能神经元的数量明显下降，亲社会行为减少，而长期给出生早期的Cntnap2基因敲除小鼠注射外源性催产素有利于其亲社会行为的恢复，从而达到治疗Cntnap2基因缺失小鼠的效果，这也是第一次有科学家直接通过实验证实孤独症相关基因与催产素之间的相互作用(Penagarikano et al. 2015)。

催产素和其受体在不同脑区的表达影响动物不同的社会行为。在中枢神经系统中，杏仁核对焦虑和恐惧反应的调节具有最重要的作用。Viviani(2015)等人的研究表明OT能抑制杏仁核（MeA)的活动水平并且使杏仁核与自主神经系统(负责对恐惧反应)之间的连通性降低，而副交感神经系统的功能增强，促肾上腺皮质激素和皮质类固醇释放减少, 从而降低个体的恐惧和焦虑水平。Gamer等(2010)报道催产素作用于杏仁核有助于减弱恐惧并提高识别恐惧和积极表情的能力。Eckstein等人招募健康的男性志愿者，让他们吸入催产素并对他们做巴浦洛夫恐怖条件反射实验，发现催产素有助于快速适应恐惧环境，从而消除条件性恐惧，所以他们认为催产素为焦虑症治疗开辟了新的蹊径(Eckstein et al. 2016)。

参 考 文 献

1. Adan R A, Van L F W,Sonnemans M A, Brouns M, Hoffman G, Verbalis J G, Burbach J P. 1995. Ratoxytocin receptor in brain, pituitary, mammary gland, and uterus: partialsequence and immunocytochemical localization. Endocrinology, 136(9):4022-4028.

2.Ostrowski N L. 1998. Oxytocinreceptor mRNA expression in rat brain: implications for behavioral integrationand reproductive success. Psychoneuroendocrinology, 23(8): 989-1004.

3.Moaddab M, Hyland B I, Brown CH. 2015. Oxytocin excites nucleus accumbens shell neurons in vivo. Mol CellNeurosci, 68: 323-330.

4.Tyzio R, Nardou R, Ferrari DC, Tsintsadze T, Shahrokhi A, Eftekhari S, Khalilov I, Tsintsadze V, BrouchoudC, Chazal G, Lemonnier E, Lozovaya N, Burnashev N, Ben-Ari Y. 2014.Oxytocin-mediated GABA inhibition during delivery attenuates autismpathogenesis in rodent offspring.Science, 343(6171): 675-679.

5. Tao R, Li H. 2015. High serum uric acid levelin adolescent depressive patients. J Affect Disord, 174: 464-466.

6. HaronyH, K M, Hoffmann J D, Klein M E, Bozdagi-Gunal O, Riad M, Daskalakis NP, SonarS, Castillo P E, Hof P R, Shapiro M L ,Baxter M G, Wagner S, Buxbaum JD. 2017. Oxytocinimproves behavioral and electrophysiological deficits in a novelShank3-deficient rat. Elife,doi: 10.7554/eLife.18904.

7.Arakawa, H., Blanchard D.C.and Blanchard R.J., 2015. Central oxytocin regulates social familiarity andscent marking behavior that involves amicable odor signals between male mice.Physiol Behav, 146: 36-46.

8.Penagarikano O, Lazaro M T, LuX H, Gordon A, Dong H, Lam H A, Peles E, Maidment N T, Murphy N P, Yang X W,Golshani P, Geschwind D H. 2015. Exogenous and evoked oxytocin restores socialbehavior in the Cntnap2 mouse model of autism. Sci Transl Med, 7(271):271r-278r.

9.Viviani, D. and Stoop,R. 2008.Opposite effects of oxytocin and vasopressin on the emotional expression of thefear response. Prog Brain Res, 170: 207-218.

10.Gamer M, Zurowski B, Buchel C.2010. Different amygdala subregions mediate valence-related and attentionaleffects of oxytocin in humans. Proc NatlAcad Sci U S A, 107(20): 9400-9405.

11.Eckstein M, Scheele D, PatinA, Preckel K, Becker B, Walter A, Domschke K, Grinevich V, Maier W, HurlemannR. 2016. Oxytocin Facilitates Pavlovian Fear Learning in Males.Neuropsychopharmacology, 41(4): 932-939.

12.Dolen G, Darvishzadeh A，HuangK W，MalenkaR C. 2013.Social reward requires coordinated activity ofnucleus accumbens oxytocin and serotonin. Nature, 501(7466): p. 179-84.

1.材料和试剂（Materials）

0.5% 戊巴比妥溶液（Sigma，美国）,青霉素、链霉素粉末 (Sigma，美国), 牙科水泥(KY195，上海新世纪，中国), 75% 酒精、无水乙醇、甲醇、二甲苯（北京化工厂，中国） 0.9% 生理盐水（山东华鲁制药有限公司，中国），0.01M PBS缓冲体系（中杉金桥生物技术有限公司，中国），人工脑脊液（ACSF ，Sigma，美国）, 催产素（Oxytocin，SLBM4784V, Sigma-Aldrich），催产素受体拮抗剂（OTR-antagonist，L2540，Sigma-Aldrich）。

手术刀柄（RWD，中国），刀片（RWD，中国），眼科镊（RWD，中国），手术剪（RWD，中国），止血钳（RWD，中国）。

2．仪器设备（Equipment）

1ml 注射器双管微量给药系统：(C=6.5mm,C.C=2.6mm, D=0.48mm)，包括：1)双导管；2)导管帽芯；3)注射内管；4）导管帽；共4个配件（RWD，中国），脑立体定位仪（Stoelting）（RWD，中国），电动颅骨钻（RWD，中国）。冰冻切片机（Leica CM1950，Leica，德国）；Micro Punch针（0.5mm，1.0mm）（北京明阳科华生物科技有限公司）；组织研磨器（天根生化科技北京有限公司）；微量自动进样泵，RWD，中国），微量注射器（HamiltonCo, Bonaduz, Switzerland），

蠕动泵（保定齐力恒流泵有限公司）；精准电子天平（上海民桥电子天平厂），离心机（Thermo Fisher Scientific，美国），移液器 （Gilson公司，法国）；超净工作台（TBD生物仪器厂，中国）；水浴锅（黄石市恒丰医疗器械厂）;动物行为学视频跟踪系统（NoldusInformationTechnology，EthoVisionXT，TheNetherlands)。

三箱装置测试区域由3个相邻的箱体组成(长105 cm×宽40 cm×高35 cm)，中间2个透明塑料分隔器分隔，并通过开放的门道使三箱连通起来。实验于暗光周期1 h后开始，行为过程采用摄像记录设备(夜视模式)记录后进行分析。

布氏田鼠是我们自己培育的封闭群，使用的是繁殖到18代的田鼠。我们所有的实验用动物都饲养在独立送排风净化动物笼（Individual Ventitaled Cage, IVC）系统里，其饲养的笼具规格是（L x W x H = 30 x 20 x 30 cm）,每笼饲养三只。动物房的昼夜节律是12：12，室温保持在22 ± 2℃，湿度是50 ± 5%。田鼠自由摄食和饮水。动物饮水、垫料和笼具均经高压灭菌处理，饲料经CO60照射消毒达到SPF级动物饲料标准。所有实验动物的使用通过了中国医学科学院医学实验动物研究所的实验动物使用和管理委员会批准，批准编号：ILAS-PG-2014-011。

为了找到调控社会行为的特定脑区，我们用WESTERN BLOTTING方法比较了大仓鼠与布氏田鼠多个脑区催产素（OT）和催产素受体（OTR）的表达差异。结果显示布氏田鼠在核杏仁和伏隔核区的催产素及其受体的表达水平都很高。而且内侧核杏仁和伏隔核是众所周知的调控动物社会行为的主要脑区。

图1 布氏田鼠（BV）与大仓鼠（GH）不同脑区OT与OTR表达的比较

为了证明这两个脑区催产素水平变化对动物的社会行为的影响，我们用催产素受体抑制剂注射布氏田鼠这两个脑区，并进行社会识别实验和攻击行为实验，来验证我们的假设。

图2 MeA区注射催产素受体抑制剂对布氏田鼠社会识别的影响

A.对空笼和刺激鼠探索时间, B.对熟悉鼠和陌生鼠探索时间

实验结果显示：MeA区注射催产素受体拮抗剂的雄性布氏田鼠组和注射人工脑脊液（ACSF）的对照组雄性布氏田鼠相比，在面对空笼和刺激鼠时，对刺激鼠的探索时间显著都高于对空笼的探索时间，初步说明内侧MeA区催产素阻断不影响雄性布氏田鼠的社会探索行为。而对不同组间进行比较发现：注射催产素受体抑制剂的布氏田鼠对空笼、熟悉鼠以及陌生鼠的探索时间都明显低于注射脑脊液的布氏田鼠对照组，说明催产素受体抑制剂能够降低布氏田鼠的社会交际行为。注射催产素受体抑制剂的布氏田鼠对熟悉鼠以及陌生鼠的探索时间没有显著差异，而注射人工脑脊液（ACSF）的对照组雄性布氏田鼠对陌生鼠的探索时间显著高于对熟悉鼠的探索时间，说明MeA区催产素的阻断能影响动物的社会记忆。

图3 MeA区注射催产素受体抑制剂对布氏田鼠攻击行为的影响

中央竞技场实验结果显示：MeA区注射催产素受体抑制剂（OTRA）的雄性布氏田鼠与注射ACSF雄性布氏田鼠相比，其攻击潜伏期和攻击时长都没有显著的差异，表明催产素在MeA区的阻断对布氏田鼠的主动攻击行为没有影响。综上所述，催产素在内侧杏仁核的表达是通过影响布氏田鼠的社会记忆，进而影响其社会交际行为，而不是改变布氏田鼠的亲社会性。

NAcc区注射OTRA的布氏田鼠与注射ACSF布氏田鼠相比，在社会识别实验第一阶段，对照组、催产素受体拮抗剂组布氏田鼠对有刺激鼠的笼子探索时间都多于对空笼子的探索时间，且都具有极显著差异；社会识别实验第二阶段，对照组布氏田鼠对陌生鼠的探索时间多于对熟悉鼠的探索时间，且有显著差异；催产素受体拮抗剂组实验鼠对陌生鼠和熟悉鼠的探索时间差异不显著。实验结果说明：NAcc注射催产素受体抑制剂不影响布氏田鼠的社会探索行为，但影响动物的社会记忆。

图4 NAcc区注射催产素受体抑制剂对布氏田鼠社会识别的影响

中央竞技场实验结果显示：NAcc区注射OTRA的布氏田鼠与注射ACSF相比，其攻击潜伏期显著减少，攻击时长显著增加，说明NAcc区注射OTRA的布氏田鼠的社会攻击行为增加。

图5 NAcc区注射催产素受体抑制剂对布氏田鼠攻击行为的影响

图6 NAcc区不同注射处理对布氏田鼠社会行为的影响

图7 p-Stat3-, OXTRA, OXT 和p-Stat3-+OXT作用于NACC区对布氏田鼠攻击潜伏期、攻击总时间的影响

综上所述我们的实验证明了布氏田鼠特定脑区的OT基因能调控动物的社会行为。而且OT在MeA区的阻断对布氏田鼠的主动攻击行为没有影响。即，OT在内侧杏仁核表达能通过影响布氏田鼠的社会记忆，进而影响其社会行为。而NAcc区催产素的阻断能增加氏田鼠的攻击行为，降低布氏田鼠的亲社会行为。

2013年Dolen等人对两组雄性C57小鼠伏隔核区（NAcc）分别注射催产素受体抑制剂和生理盐水后，进行条件位置偏好实验，注射OTRA组小鼠的对熟悉奖励区域探索时间比注射生理盐水的对照组小鼠少，因此其社会偏好不明显。当给正常小鼠NACC注射5-羟色胺酸受体1b沉默的慢病毒2周之后，条件位置偏好实验发现注射组小鼠的熟悉奖励区域探索时间较少，社会偏好不明显。通过电生理检测NACC中型多棘神经元兴奋性突触后电位发现，注射生理盐水组小鼠的电位平缓，注射催产素受体抑制剂组和注射慢病毒组电位活跃。据此Robert等人推测催产素与神经递质5 -羟色胺酸（5-HT）相互作用，并能够诱导产生长时程抑制效应（Long-term depression, LTD），抑制中型多棘神经元活性，从而减少γ氨基丁酸(gammaaminobutyric acid, GABA)的合成分泌。此外OT诱导LTD的形成需要5 -羟色胺酸受体1b的参与，1b受体的缺失将阻碍社会奖励行为。

Dubrovsky等人对大鼠侧脑室注射催产素之后，通过避暗实验检测OT对大鼠学习记忆能力的影响，注射OT组的大鼠相较于实验对照组的大鼠能够较快的记忆暗箱电击，表现较强的学习记忆能力，并用电生理方法检测海马齿状回（DG）兴奋性突触后电位的变化(Dubrovskyet al. 2002)。研究结果显示DG区域突触后电位活跃，并且能够持续2小时。Dubrovsky等推测OT能够显著增强长期增益效应(Long-termpotentiation，LTP)，由于记忆被认为是由突触强度的改变来编码的，LTP被普遍视为构成学习与记忆基础的主要分子机制之一，对个体的学习、记忆有显著效果(Nateghet al. 2016)。

2015年Smith等人对田鼠PVN注射OT，然后进行高架十字迷宫实验，利用免疫组化方法观察生物神经活动的标志物c-Fos的表达情况，实验结果显示OT注射之后，与正常对照组田鼠相比，在开臂时间较多，免疫组化结果显示c-Fos表达较少，这就表明催产素能够改善动物焦虑。当同时注入OT及GABA受体抑制剂时，研究γ-氨基丁酸(GABA)对OT的影响，GABA是一种抑制性的神经递质，能够调节下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)应激反应，实验结果显示OT及γ-氨基丁酸受体抑制剂注射组田鼠与正常对照组田鼠相比，在闭臂时间较多，表明OT对焦虑的缓解作用依赖GABA的作用。OT通过诱导产生GABA，调节下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)应激反应水平，减少促肾上腺皮质激素和皮质类固醇的释放,使得防御和攻击行为减少，促使社会接触行为增加和社会关系的建立(Smithet al. 2014，Smith et al. 2016)。

Harony等研究发现敲除SHANK3基因减弱了大鼠的长期社会识别记忆、注意力以及海马区突触重塑的功能，在SHANK3基因敲除大鼠的左侧侧脑室注射催产素后，大鼠的长期社会识别记忆、注意力以及海马区突触重塑的功能得到增强，从而证明催产素可以用来治疗由SHANK3基因突变引起的自闭症谱系障碍患者（autism spectrum disorder，ASD） ADDIN NE.Ref.{70069622-F870-4FA6-A0DF-5D1D51E4A8F2}(Harony et al. 2017)。

综上所诉，基础研究显示催产素通路障碍可能会导致精神类疾病的发生和发展。而大家一致认同催产素不是独立作用的，它能够与一些其他的激素共同作用调节生物行为，例如加压素（AVP）、多巴胺（Dopamine,DA）等，但是其相互作用机制目前还不明确(Carter et al. 2015)。

创新性和比较医学应用价值:本项目首次提出啮齿动物中决定动物亲社会行为的主要脑区是伏隔核区（Nacc），并提出该区催产素通路阻断能改变动物的亲社会性。（2）本项目首次提出Nacc区催产素路径阻断能造成动物社会行为的变化。

技术关键点及难点:特定脑区立体定位注射技术。